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奶牛乳房周围环境及乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

时间:2013-09-24 11:11:39   来源:华中农业大学兽医外科学   作者:佚名    点击:408次

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化学、微生物等因素的刺激所发生的一种炎症变化,是一种多因素疾病综合征。

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化学、微生物等因素的刺激所发生的一种炎症变化,是一种多因素疾病综合征。

奶牛乳房炎是目前危害奶牛养殖业的主要疾病之一,每年可造成巨大的经济损失。目前全世界共有2.2亿头奶牛,其中1/3患各种类型的乳房炎。可引发乳房炎的病因有多种,但生物性因素仍为引发奶牛乳房炎的主要病因。奶牛乳房炎的病原具有多样性,目前已分离到与奶牛乳房炎有关的病原微生物共有150多种,有细菌、真菌、霉形体、病毒和原囊藻类生物等。较常见的有23种,其中细菌14种,霉形体2种,真菌和病毒7种。细菌性病原主要以金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、星形诺卡氏菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、爱德华氏菌、肠杆菌、结核杆菌、多杀性巴氏杆菌和绿脓杆菌等。与奶牛乳房炎有关的真菌有新型隐球菌、念珠菌属、霉菌和毛孢子菌属真菌,其中以酵母样真菌为主。已证实牛疱疹病毒(BHV)-1、BHV-4、口蹄疫病毒和副流感病毒-3(PI3)能够引起牛临床型乳房炎,而BHV-2、牛痘病毒、伪牛痘病毒、疱疹性口炎病毒、乳头状瘤病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛免疫缺陷性病毒对牛乳房炎均有直接或间接的作用;此外,还有学者从牛的乳腺组织中分离到牛白血病病毒,但尚未证实该病毒可引发乳房炎。牛霉形体可引起牛乳房炎,但发病率较低,但一旦出现则病情较重且诊断不易。此外,近年来原囊藻类生物引起奶牛乳房炎的报道也逐渐增多。

虽然有多种病原微生物可引起奶牛乳房炎,但国内外公认的最常见、最主要的病原为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌和大肠杆菌等肠杆菌,近年来的报道表明凝固酶阴性葡萄球菌性乳房炎的发病率逐渐上升。长期以来,牛场兽医对奶牛乳房炎的治疗以抗生素治疗为主,但常规抗生素治疗的结果并不理想。为进一步了解奶牛乳房周围环境中存在的细菌和真菌与奶牛乳房炎病原菌的关系,并探究有效的抗生素治疗药物,笔者对北京地区三个规模化牛场进行微生物学调查和药敏试验,以期为乳房炎的防治提供一些可用的信息。

1 材料与方法

1.1待检材料

(1)选择北京三元绿荷的3个规模奶牛场作为实验基地,以临床健康牛(BMT检测阴性)、隐性乳房炎患牛(BMT阳性)的各30个乳区的乳汁作为实验材料。

(2)采集挤奶机内套及乳头孔处样品各20份。

(3)选取临床型发病乳区60个,于采取治疗措施之前,对患乳区乳头严格消毒,采取奶样(2mL/乳区)至无菌管内。

1.2培养基

血液培养基平板、普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、BBC血平板、厌氧血平板、M-H平板,均购自天津金章科技发展有限公司。

1.3 生化鉴定试剂与试纸条

API 20E(肠杆菌和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统),API 20NE (非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统),API Staph(葡萄球菌和微球菌鉴定系统)和API 20 Strep(链球菌鉴定系统)及配套试剂。以上试剂与试纸条均购自生物梅里埃中国有限公司。

1.4 药敏纸片

青霉素,氨苄西林,庆大霉素,环丙沙星,诺氟沙星,卡那霉素,红霉素,链霉素,氧氟沙星,氯霉素,阿米卡星,苯唑西林,头孢唑林(先锋V),头孢噻肟,头孢氨苄,四环素。购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.5 其它

革兰氏染液、比浊管(McFarland Standard)(内装0.5、1、2、3、4、5号麦氏比浊管)一套、简装无菌棉拭子以及API专用一次性加样管,购自生物梅里埃中国有限公司;无菌生理盐水(规格:500ml/瓶),北京双鹤药业股份有限公司产品;带试管无菌棉拭子,购自天津金章科技发展有限公司。乳酸酚棉蓝染色液,10%KOH溶液。

2 试验方法

2.1 样本采集

经BMT对所选奶牛进行隐性乳房炎检测,选取正常乳区30个、隐性乳房炎阳性乳区30个。用75%酒精溶液消毒乳头孔处后,倾斜带无菌棉拭子的试管,将管口对准乳头孔,采集乳汁3-5ml。乳房炎患乳区乳样采集方法同上。临床型乳房炎乳样采集方法同上。

将营养肉汤干粉按说明书配制成溶液,经高压灭菌后,分装于带有无菌棉拭子的试管中,每管3ml。用该管中的棉拭子直接涂擦挤奶机内套和试验牛只的乳头孔处,取完立即放入试管内。

采样过程严格无菌操作。

2.2 微生物分离培养、鉴定

所采得样品,在采样后30min内按微生物学方法进行有氧培养、厌氧培养和真菌培养。培养所得细菌与真菌经纯培养后,经染色镜检后,参照《API细菌鉴定金标准》、《临床微生物学诊断与图解》和《Medically Important Fungi: a guide to identification》进行形态学和生化鉴定。

2.3 药敏试验

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)下设的纸片扩散法敏感试验分委会推荐的标准方法所编译的《纸片法药敏试验操作方法》对所得细菌进行药敏试验。

3 结果

3.1 细菌培养结果

30份常乳样本培养得细菌14株,培养阳性率为40%;30份隐性乳房炎患乳区乳样培养得细菌33株,样品培养阳性率为60%;乳头孔处所取20份样本共培养得细菌127株,样品培养阳性率100%;挤奶机内套所取的20份样品培养得细菌7株,样品培养阳性率25%;临床型乳房炎所取60份乳腺分泌物培养得细菌69株,样品培养阳性率为81.7%。鉴定结果参见表1。

表1 细菌生化鉴定结果

 

正常乳样

隐性乳房炎阳性乳样

乳头孔处样品

挤奶机内套所取样品

临床型乳房炎样品

金黄色葡萄球菌

6

9

20

2

10

表皮葡萄球菌

0

9

17

1

9

缓慢葡萄球菌

0

0

6

0

1

大肠埃希氏菌

5

4

20

2

18

无乳链球菌

2

5

14

0

2

停乳链球菌

1

4

9

0

3

乳房链球菌

0

0

5

0

0

牛链球菌

0

0

3

0

2

肺炎克雷伯菌

0

0

7

1

11

星形诺卡氏菌

0

0

0

0

4

牛棒状杆菌

0

2

0

0

2

睡眠嗜血杆菌

0

0

0

0

1

微球菌

0

0

5

1

2

其它菌株

0

0

21

0

4

合计

14

33

127

7

69

上表中乳头孔处所培养得其他菌多为环境中常在的菌,如枯草杆菌、栖稻黄色单胞菌、浅金黄色单胞菌、阴沟肠杆菌、科氏葡萄球菌等,极少引发奶牛乳房炎这里不再赘述。乳房炎患乳区分泌物中所检出的细菌未在表中列出的分别为:猪链球菌1株、粪肠球菌1株、聚团肠杆菌1株、产酸克雷伯菌1株。

3.2 真菌培养结果

30份隐性乳房炎患乳区乳样培养得酵母样真菌5株;乳头孔处所取20份样本共培养得真菌共16株,其中霉菌13株,酵母样真菌3株;临床型乳房炎所取60份乳样培养得真菌4株,其中霉菌3株,酵母样真菌1株;30份正常奶样和挤奶机内套处所取样品未培养出真菌。鉴定结果参见表2。

表2 真菌培养鉴定结果

 

隐性乳房炎阳性乳样

乳头孔处样品

临床型乳房炎乳样

白色念珠菌

5

3

1

黑曲霉

0

3

2

青霉属

0

5

0

黄曲霉

0

4

0

烟曲霉

0

1

1

合计

5

16

4

3.3 药敏试验结果

分离到的葡萄球菌,对青霉素类药物中的青霉素G和氨苄西林以具有耐药性,对苯唑西林敏感;对氨基糖苷类药物庆大霉素敏感,其中的多数对卡那霉素也敏感,但试验过程中菌株耐药;对头孢类药物的敏感性较其他类药物高,多数菌株对氯霉素敏感。链球菌对氨苄西林、氯霉素、四环素以及头孢类药物敏感,试验过程中未发现耐药菌株。所分离到的大肠杆菌和克雷伯菌对多数参试药物敏感。自临床型乳房炎乳样中分离到的星形诺卡氏菌仅对参试药物中的氯霉素敏感;猪链球菌对氨苄西林和氯霉素敏感;粪肠球菌对氨苄西林、头孢唑林、庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星和四环素敏感;聚团肠杆菌对氨苄西林、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、诺氟沙星和链霉素敏感;产酸克雷伯菌对卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、诺氟沙星和链霉素敏感。

4 讨论

4.1 奶牛乳房炎的病原菌的地区性差异

细菌和真菌是引发奶牛乳房炎的主要生物性因素,多年来,广大国内外学者对世界各地可导致奶牛乳房炎的病原菌进行了调查研究。部分国内文献报道的统计结果参见表3。

表3奶牛乳房炎的病原菌的地区性差异

报道者

病原菌

葡萄球菌

链球菌

杆菌

其它

张中文

23.81%

39.69%

25.39%

11.11%

张晓菊

73%

20.3%

1.9%

4.8%

殷波

26.6%

63.4%

6.7%

3.3%

王志远

31.34%

52.2%

14.93%

1.53%

王效田

35.29%

11.76%

29.41%

23.54%

王赟

41.8%

29.9%

4.5%

23.8%

许丹宁

37.29%

38.98%

23.73%

冀玉浈

29.41%

56.86%

11.76%

1.97%

孔雪旺

20.97%

46.77%

9.68%

22.58%

在印度学者Daljeet等对奶牛真菌性乳腺炎的研究中,所检验的450份临床或亚临床患乳房炎黄牛的奶样中,有56头牛患真菌性乳房炎,其中酵母样真菌奶样48份(占85.7%)、霉菌8份(占14.3%)。

4.2 病原菌的药物敏感性与耐药性

本试验中所分离到的葡萄球菌,对青霉素类药物中的青霉素G和氨苄西林以具有耐药性,对苯唑西林敏感;对氨基糖苷类药物庆大霉素敏感,其中的多数对卡那霉素也敏感,但试验过程中菌株耐药;对头孢类药物的敏感性较其他类药物高,多数菌株对氯霉素敏感。可能与目前牛场兽医临床的用药方式有直接关系。

大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对参试药物大多敏感;链球菌对氨苄西林、氯霉素、四环素以及头孢类药物敏感。但所分离到的星形诺卡氏菌对大多数抗菌药物耐药。

目前,国内外学者与牛场兽医对奶牛乳房炎病原菌的药敏实验结果不一。对细菌性病原,青霉素类药物、庆大霉素、卡那霉素、氧氟沙星、新霉素和头孢类药物等的杀菌效果较佳;对真菌性病原,制霉菌素效果较好。

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