返回首页 收藏
 
注册 《奶业在线》

中国奶业信息网,聚焦奶业热点,构建全产业链信息平台!

倪和民-抑制素的研究与临床应用进展

时间:2014-11-05 09:37:28   来源:奶牛产业技术体系北京市奶牛创新团队   作者:吴迪、齐晓龙、孟洪、倪和民*    点击:378次

抑制素(Inhibin,INH)属于TGF-β家族,是一种由二硫键偶联的糖蛋白激素,主要来源于家畜的睾丸和卵巢,可抑制脑垂体FSH的分泌,但目前对抑制素的作用机理尚不明确,人们正对此进行着一系列研究。现通常用不同方法获得的抑制素免疫原主动或被动免疫家畜,均可提高家畜的排卵率。

    摘要:抑制素(Inhibin,INH)属于TGF-β家族,是一种由二硫键偶联的糖蛋白激素,主要来源于家畜的睾丸和卵巢,可抑制脑垂体FSH的分泌,但目前对抑制素的作用机理尚不明确,人们正对此进行着一系列研究。现通常用不同方法获得的抑制素免疫原主动或被动免疫家畜,均可提高家畜的排卵率。 

    关键词:抑制素,排卵率,免疫

   1923年,人们提出了在睾丸内有一种物质,它可以抑制垂体激素的分泌, 1932年,McCullagh验证了此说法,从睾丸组织中提取出一种物质,可以抑制垂体细胞的形成,将这种物质取名抑制素,抑制素的概念因此正式提出[1]。1985年Robertson从牛卵泡液分离得到纯化的抑制素。研究结果表明,抑制素α亚基在动物繁殖和人类生殖、内分泌敏感肿瘤的发生、发展中起重要的调控作用。

    1.抑制素的结构特性

    1.1抑制素的分子结构

    抑制素系一种二硫键偶联的二聚体糖蛋白激素,属于TGF-β家族成员。抑制素由一个α亚基连接βA或βB亚族组成抑制素A(αβA)和抑制素B(αβB)。激活素是由2个β亚基组成的二聚体,具有3种不同的形式即激活素A(βA-βA)、激活素AB(βA-βB)、和激活素B(βB-βB)。α、βA、βB亚基起源于由3种不同的基因编码的前导多肽。不同的转译后的加工,尤其是α亚基前导序列,导致了inhibinA和B不同形态的形成。抑制素和激活素最早在卵巢卵泡液中被发现,其功能为调节体外脑垂体性腺激素FSH的分泌。

    1.2抑制素的生物学特性

    抑制素不耐热,80℃以下时在培养基中加热30min、在有机溶剂中加热到65℃以上,生物活性即被破坏分泌。抑制素在PH为1.8~4.0时和在7.0~10.0时较为稳定,可以进行纯化、冷冻与干燥。但在蛋白质分解酶、pH4.0~7.0、氧化或还原条件下均可很快使之失活,并且易与蛋白质结合。抑制素分子量在31Kda、32Kda、55—65Kda时较易纯化。抑制素含有2个半衰期,可能由于二聚体不具有糖基化位置,与抑制素相比更易在血中被清除 [2]。

    2.抑制素在机体内的代谢调节

    2.1抑制素的来源

    抑制素主要由家畜的性腺分泌。目前已从牛、绵阳、猪的卵泡液和睾丸网液中提取出了抑制素。因此抑制素普遍认为主要产生于卵巢颗粒细胞或睾丸支持细胞。通过免疫组化定位法发现在猪的精母细胞与精原细胞,母羊的脑、肝脏、肾脏、肺脏、子宫组织中也存在抑制素。牛卵泡中抑制素含量随卵泡增大而增加,随卵泡的闭锁而减少。在卵母细胞的体外培养中,去除颗粒细胞的卵母细胞抑制素含量仅占有完整颗粒细胞卵母细胞的20%。

    2.2抑制素与激活素对颗粒细胞的增殖调节

    抑制素主要由雌性动物卵母细胞中颗粒细胞和雄性动物睾丸支持细胞分泌,可协同激活素通过自分泌与旁分泌路径调节FSH激素水平。Greenwald和Roy[3]在1994年研究发现,激活素可促进FSH受体在颗粒细胞上的表达,一旦颗粒细胞获得了FSH受体,它便主要受FSH激素的驱动,同时受外界因子如胰岛素、生长激素和瘦素的调节,并且自身分泌刺激因子如IGF、激活素与抑制因子如TGF-α。抑制素通过与激活素受体结合,抑制了激活素对颗粒细胞的作用,从而间接调节颗粒细胞的增殖过程。

    抑制素可以促进动物体合成分泌雌激素。雄烯化酶在进入卵巢颗粒细胞后,在芳香化酶的催化作用下,即可转变为雌激素。而抑制素可增加芳香化酶的活性,使雌激素大量生成。过量雌激素的产生会负反馈性抑制脑垂体FSH的分泌。

    2.3抑制素对卵母细胞体外成熟的影响

    体外成熟的卵母细胞缺乏体内卵母细胞优势选择的调控过程,会对随后的发育产生一定影响,导致受精后卵裂率和囊胚率低等现象。1999年Silva研究表明[4],游离的抑制素α亚基或其表达蛋白可以减少卵母细胞的发育能力,但抑制素A不具备此能力,然而在卵母细胞培养液中添加抑制素α亚基抗抑制素抗体可以增加卵母细胞的发育能力。卵母细胞在体外培养环境中会在封闭的培养液中产生抑制素,可能会对卵母细胞成熟产生不良影响。于建宁等[5]在卵母细胞体外培养液中添加50 ug/ml和100ug/ml的抗抑制素抗体,结果表明,卵母细胞成熟率提高了3.8%和7.6%。间接说明了抑制素会阻碍卵母细胞成熟。

    3抑制素的免疫调节功能

    3.1抑制素的作用机理

    抑制素的生理作用是可以抑制体内FSH合成和分泌,并可通过复杂的反馈调节机制调节机体体液水平,从而对卵巢上卵泡发育起到调控作用。因此,对动物体进行免疫抑制素可以在体内产生抗抑制素抗体,中和内源性抑制素,使FSH的合成和分泌不受抑制,从而增加血液中FSH的含量,而且抑制素免疫可以直接阻止排卵前FSH的降解,相对上升了FSH水平,提高排卵数[6]。

    激活素的受体存在于卵母细胞的颗粒细胞、膜细胞中,然而目前尚未发现抑制素的特异性受体。直到最近人们发现,抑制素通过α亚基与TGF-β家族Ⅲ型受体上的β聚糖紧密结合,这种结合显著增强了抑制素β亚基与激活素Ⅱ型受体的结合。基于此发现作者推断,抑制素也许会干扰激活素与它的Ⅱ型受体的结合,从而影响激活素发挥其生理作用。更进一步的推断指出,游离的抑制素α亚基可以促进激活素的功能。游离的抑制素α亚基可以与抑制素中的α亚基竞争β聚糖,减弱了抑制素与激活素Ⅱ型受体的相互作用,间接使激活素与受体结合发挥其生物学功能。因此,游离抑制素α亚基的功能类似于抑制素的拮抗剂或激活素的激活剂[7]。

    对动物体进行抑制素免疫可持续性的提高动物体内FSH水平。有研究表明,对绵阳进行一次抑制素免疫后,在未来2—3年绵阳体内仍保持着较高效价的抗抑制素抗体,并始终维持着高水平的FSH分泌,产羔数也维持在较高水平 [8]。这说明抑制素可对卵巢产生持久的作用效果。这预示着在免疫抑制素后机体内FSH水平升高,是卵巢中雌激素升高,从而又负反馈抑制FSH分泌,使FSH水平回归正常。

    3.2抑制素的免疫原性

    抑制素免疫可分为主动免疫和被动免疫。两种免疫方法均可使动物产生抑制素抗体或抗抑制素抗体,中和体内内源性抑制素,使血液中的FSH浓度升高,提高卵巢的活性,促进卵泡发育,从而提高排卵率。其中主动免疫即利用免疫原刺激机体B淋巴细胞产生免疫应答,生成相应的抗抑制素抗体。抗抑制素抗体可中和体内内源性抑制素,解除对FSH的负反馈调节抑制。抑制素免疫源可分为3种,一是用动物性腺提取物来制备免疫原,如可将动物睾丸组织、精液、卵泡液作为免疫原进行免疫。用卵泡液作免疫原时,通常要用活性碳处理以除去类固醇,免疫效果会因抑制素提取浓度不同而有差异;二是用化学方法合成的抑制素多肽免疫原,即用抑制素肽段与载体蛋白融合获得免疫原;三是借助基因工程技术来合成。近年来,通过提取卵巢总RNA并反转为cDNA,并将目的基因连接到表达载体得到的抑制素α-亚基融合蛋白可直接用于免疫动物,并具有免疫原性高,排卵率效果显著等优点。

    抑制素被动免疫即用免疫原先免疫兔、鸡等中间动物,采血收集血清并用间接ELISA法检测抗体效价,再用血清抗体或卵黄抗体免疫欲免疫的动物。被动免疫产生的效果十分迅速。

    3.3抑制素在卵泡发育中的作用

    动物体卵泡发育受下丘脑—垂体—性腺轴的调控,这种调控使得动物体卵巢上的卵泡从原始卵泡的发育、选择、优势化至成熟排卵的各个环节循环有序的进行着,并保留着最原始的排卵数。许多研究结果表明,抑制素是动物体卵泡发育过程中的反馈调节因素,它与FSH呈负相关关系。因此推断出抑制素是动物体排卵数的原始信号并调控着FSH的分泌。

    抑制素在优势卵泡调控方面起着至关重要的作用,Woodruff(1990)[9]认为当一群卵泡发育到一定阶段时,卵母细胞周围颗粒细胞会分泌释放抑制素,从而随血液循环抑制FSH的分泌,由于优势卵泡可通过卵巢局部调节因子ACT、IGF-1等调节来增强自身对垂体促性腺激素的敏感性,从而避免因FSH降低而闭锁退化。而非优势卵泡最终因血液循环中FSH降低而发生卵泡闭锁,所以,抑制素在优势卵泡的选择上十分重要。

    4.抑制素在动物繁殖中的应用

    4.1抑制素对动物排卵的免疫调节

    对动物体进行抑制素主动免疫或被动免疫可促进动物排卵。最早的报道源于1982年O’Shea的试验,用牛卵巢卵泡液抑制素粗提物主动免疫绵阳,可增加绵阳的排卵数。随后,Cummins[10]验证了他的试验,用牛卵泡液抑制素粗提物配合弗氏佐剂主动免疫美利奴羊,结果免疫组平均排卵数(2.3)比对照组(1.2)高出一倍之多,由此抑制素免疫正式拉开序幕。Mohamed等人将猪抑制素α亚基N端1—32位氨基酸序列连接兔血清白蛋白作为免疫原免疫母羊,与对照组相比,免疫组使血浆中的FSH浓度显著提升,排卵率免疫组(14.4±2.2)显著高于对照组(2.2±0.6)[11]。桑润滋等用猪精液抑制素冻干粉配合弗氏佐剂作为免疫原,对20头母牛进行抑制素免疫,结果表明,免疫牛卵泡发育率和排卵率分别比对照组提高45.5%和18.2%[12]。说明对母牛主动免疫抑制素可促进母牛卵泡发育,提高排卵率。

     对动物体被动免疫抑制素同样可促进排卵。田谷一善[13]对12只SHIBA山羊用抗抑制素血清(INH-AS)进行被动免疫,结果表明,INS-AS可中和体内内源性抑制素,解除对FSH的抑制作用,从而促进排卵。陈守云[14]制备了抑制素卵黄抗体,即用人抑制素α亚基与KLH蛋白偶联作为免疫原,免疫16只产蛋母鸡,收集鸡蛋,提取并合并抗体效价高的卵黄液,获得特异性较好的抗抑制素eIgY。结果表明,免疫后山羊血液中LH、FSH、E2均升高,可促进排卵。

    4.2抑制素可诱导动物双胎的产生

    在肉牛的生产过程中,通常是一胎次产一犊牛。我国肉牛业发展受肉牛繁殖数量不足所限,而抑制素可诱导动物双胎的产生。牛树理[15]等人从猪精液中提出抑制素并免疫黄牛分别得到31.6%(6/19)和36%(4/11)的发情母牛排双卵率。Morris等人将三段牛抑制素α亚基多肽序列18—30、63—72、107—122连接到人血清白蛋白中作为免疫原,对海富特牛进行免疫,可增加母牛的排卵率和双胎率[16]。杨利国等利用猪精液抑制素粗提物主动免疫经产母牛,有15头产双胎,孪生率达26.3%(15/57)。

    4.3抑制素相比其他促性腺激素的优越性

    超数排卵是胚胎移植技术中的关键环节之一,目前常用到的超排药物主要为FSH、孕马血清、氯前列烯醇,但是由于超数排卵是一项复杂的生理过程,加之生产促性腺激素厂家批号不同以及动物个体的差异,致使生产中应用促性腺激素导致的超排效果不稳定。由于使用促性腺激素如FSH的半衰期较短,因此需要频繁注射给药,这在对奶牛进行超排处理时可能会在奶中有药物残留。而采用抑制素免疫法进行超排处理不仅可以提高排卵率,而且能够增加最终的可用胚胎数,并且无药物残留风险。有研究认为对动物肌肉注射促性腺激素可能会加重负反馈调节剂的分泌,对卵巢造成一定影响,而使用抑制素免疫可避免这种伤害。

    5展望

    目前对抑制素的作用机理及其受体的研究尚不明确,但抑制素在家畜生殖生理中的作用与认识正逐渐深入。由于牛是单胎动物,其在自然状态下每个发情周期中只能排出一个卵母细胞,大大的限制了其繁殖能力。因此人们试图寻找一种方法来增加动物的排卵率。目前常用于超数排卵的激素有促卵泡素(FSH)、孕马血清促性腺激素(PMSG)、盐酸氯前列烯醇(PGF2α),使用进口激素或国产激素均可达到超数排卵的效果,但进口激素费用太高,不适于大规模超数排卵,而国产激素又存在质量或效能不稳定等问题。因此,应用抑制素免疫动物可介于进口激素与国产激素之间,既保证超排质量又可降低成本。抑制素可为增加动物排卵率,双胎率和多胎率起到推动作用[17] 。

    然而应用抑制素对动物体进行免疫仍存在一些问题,如对于精液和卵泡液中的抑制素分离与纯化相对较难,另外,免疫剂量的选择控制、免疫佐剂的使用、抑制素重组蛋白的纯化以及目的基因与载体蛋白的偶联均无明确的参考标准,有待于进一步攻克解决 [18]。

    随着基因工程的发展,抑制素免疫作为一种新兴技术已逐渐应用于畜牧业实际生产之中。今后研究的重点将主要集中在如何提高抗原质量,降低成本,克服个体差异以及解决免疫过程中出现的蛋白纯化、摇菌等问题。同时,在对动物体进行抑制素免疫时,应注意免疫剂量的选择。相信在不久的将来,抑制素免疫在超排过程中会逐渐替代FSH的作用,并大规模的投入到实践中去!(参考文献略)

(责任编辑:不存在)

上一篇:伊利夏晓平谈繁育管理下一篇:没有了
Copyright © 1999-2017 All Rights Reserved. 中国奶业信息网 版权所有
版权声明:转载请保留 中国奶业信息网 字样
公司地址:北京市朝阳区望京东路锐创国际中心2号楼1012
联系电话:13911574412 10-65980517/65980535/65980579